鵝傳染性漿膜炎核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)
2025-01版
【產(chǎn)品名稱】
商品名稱：鵝傳染性漿膜炎核酸檢測試劑盒（熒光-PCR法）
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預期用途】
鵝傳染性漿膜炎是由鴨疫里默氏桿菌病(Riemerella anatipestifer)引起的一種接觸性傳染性疾病。本試劑盒適用于檢測鵝呼吸道、消化道或皮膚的傷口等組織樣本或病鵝的血液樣本中的鴨疫里默氏桿菌，用于鴨疫里默氏桿菌感染的輔助診斷。
【檢驗原理】
本試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術(shù)，設計1對鴨疫里默氏桿菌特異性引物，結(jié)合1條特異性探針，用熒光PCR技術(shù)對鴨疫里默氏桿菌的核酸進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】
名 稱 | 規(guī) 格 |
RA酶液 | 25μL×1管 |
RA反應液 | 975uL×1管 |
RA陽性質(zhì)控品 | 50μL ×1管 |
陰性質(zhì)控品 | 50μL ×1管 |
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融不超過5次，有效期12個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。
【標本采集】
病死或撲殺的鵝，無菌剪取呼吸道、消化道或皮膚的傷口樣品1g；生禽取血液樣品，抽取1ml血液進行測試
【保存和運輸】
上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過6個月，標本運送應采用2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1 樣本前處理
組織樣品：每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中；全血樣本：待血凝固后，取血清100μL于1.5mL滅菌離心管中。
1.2 DNA提取
為了使實驗結(jié)果穩(wěn)定、有效、可靠，建議使用商品化的DNA 提取試劑盒進行提取，嚴格按照對應試劑盒說明書進行操作。
2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的PCR反應管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照；樣品每滿7份，多配制1份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑 | RA反應液 | 酶液 |
用量（樣本數(shù)為N） | 19.5μL | 0.5μL |
3. 加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟1提取的DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取5μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4. PCR擴增（核酸擴增區(qū)）
4.1 將待檢測反應管置于熒光定量PCR儀反應槽內(nèi)；
4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為25μL；
熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM檢測鴨疫里默氏桿菌，淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設置：
步驟 | 循環(huán)數(shù) | 溫度 | 時間 | 收集熒光信號 |
1 | 1 cycle | 95℃ | 3min | 否 |
2 | 40 cycles | 95℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5. 結(jié)果分析判定
5.1 結(jié)果分析條件設定
設置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。
5.2 結(jié)果判斷
陽性：檢測通道Ct值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。
可疑：檢測通道35.0<Ct值<38.0，且出現(xiàn)典型擴增曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結(jié)果出現(xiàn)Ct值<38.0且有典型擴增曲線者為陽性，否則為陰性。
陰性：樣本檢測結(jié)果無Ct值且無明顯的擴增曲線。
6. 檢測方法的局限性
? 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；
? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；
? 陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結(jié)果；
? 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結(jié)果；
? 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結(jié)果；
? 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果；
? 本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。
7. 質(zhì)控標準
陰性質(zhì)控品：無明顯擴增曲線且無Ct值顯示；
陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且Ct值≤30；
以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
8. 性能指標
（1）敏感性：內(nèi)控樣本敏感性為100%，綜合評價敏感性98%以上。最低檢測限不低于1000copies/ml。
（2）特異性：100%。
（3）穩(wěn)定性：批內(nèi)及批間差異≤3%。
【注意事項】
? 所有操作嚴格按照說明書進行；
? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，完全混勻并短暫離心；
? 反應液應避光保存；
? 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；
? 實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
? 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。
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